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琼脂糖凝胶电泳是一种电泳形式,用于根据核酸(DNA或RNA)片段的大小进行分离。当施加电流时,带负电的DNA/RNA通过琼脂糖凝胶的孔隙向凝胶带正电的一端迁移,较小的片段迁移较快。由此产生的条带可以用紫外线(UV)光来观察。
动物组织:100 mg(黄豆大小),最少50 mg(绿豆大小),脂肪组织,结缔组织,纤维化组织适当增加,干冰运输。
细胞:1×10^6个细胞。细胞沉淀或者加入trizol的细胞样本(不要直接运输加trizol的细胞培养皿),干冰运输。
全血:最少1 mL新鲜血液EDTA抗凝管,-20℃运输。
血清:最少1 mL,干冰运输。
植物:新鲜的叶、果肉、种子等需100 mg,干冰运输。
PCR产物:体积≥10 μL,干冰运输。
1.条带缺失:
原因:可能是DNA条带分子量过大,分子量接近的DNA条带没有分开,电泳缓冲液使用不当,电泳时间过长或电压过高导致DNA走出凝胶,或者电极插反。
解决方法:对于分子量过大的DNA条带,可以使用脉冲凝胶电泳;选择适当的凝胶浓度进行电泳以分离分子量接近的DNA条带;根据电泳缓冲液的性质选择合适的电泳条件;缩短电泳时间,调整电压;确保电极连接正确。
2.条带模糊或弥散:
原因:可能是电泳缓冲液多次使用后失效,核酸部分降解,核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份,电压过低或电泳时间过长,染色时间过长或拍照前放置过久。
解决方法:定期更换电泳缓冲液;使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品;通过酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质;根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳;电泳结束后及时观察、拍照。
3.凝胶制备问题:
问题:微波炉溶解琼脂糖时,胶液可能冲溢出三角锥瓶;琼脂糖没有完全溶解会造成电泳图像背景模糊不清;加热后水分蒸发可能导致凝胶浓度不准确。
解决方法:确保总液体量不超过三角锥瓶的50%容量;对于2%以上的胶液,使用中火加热;当胶液剧烈沸腾时,停止加热,摇动三角锥瓶,然后再次加热直至胶液清澈;如需补水,应加入热的蒸馏水,并摇匀。
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