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项目简介：
微生物多样性测序是对环境样品中细菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的DNA进行特定长度的PCR扩增并对扩增产物进行测序的分析，可实现对环境样品中的优势物种、稀有物种和一些未知物种进行检测，精准解析微生物在种属水平上的组成和丰度情况，是当前研究环境微生物多样性及群落组成差异的重要技术手段。
细菌微生物多样性
16S rDNA测序：16S rDNA具有10个保守区和9个高变区。保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异。对16S rDNA某个高变区进行测序，用于研究环境微生物中的群落结构多样性。
16S rDNA序列及常用扩增引物序列
真菌微生物多样性
18S rDNA测序：18S rDNA也包含可变区和保守区。对18S rDNA某个高变区进行测序，用于研究环境样本中真核微生物群落结构多样性。ITS1测序：ITS分为两个区域：ITS1和ITS2。ITS区域进化速率是18S rDNA的10倍之多。对ITS1和ITS2进行测序，用于研究环境样本中真核微生物群落结构多样性。
ITS rDNA序列及常用扩增引物序列
技术路线
功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到广泛关注的一类微生物，如硝化细菌、反硝化细菌、氨氧化细菌、硫酸盐还原菌、固氮菌等，使这些功能细菌发挥这种特定功能的基因就称为功能基因，如AOA、AOB、nifH等。功能基因测序，是根据复杂环境中具有特殊功能的微生物基因序列设计引物，用该引物进行PCR扩增，建库后进行高通量测序。功能基因测序可有效研究特定环境中的功能微生物物种信息，包括：功能微生物功能差异、分类和丰度等，并与每个采样点的环境因子相结合，可以同时分析环境因子与功能细菌群落结构的关系，因此对复杂环境中的微生物构成研究
基因组DNA样本浓度至少大于50ng/μl，体积不少于10μl
菌液样本：500ul菌液
鉴定只接收纯化后的单一菌种，不接受具有致病性的样品
实验样品不纯造成的测序套峰，我们将收取全额的实验费用
环境样品 | 送样要求 | 保存及运输 |
普通土壤 | 除去土壤表层未分解的凋落物层、动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品捣碎，过2mm筛后，分装至2mL或更大体积的EP管或冻存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g。 | 样本-80℃或液氮中长期保存，干冰运输 |
根际土壤 | 收集植物植株，去除根部大块土壤；摇动植株去除附着不紧密的土壤，使用无菌刷子收集根部附着紧密的土壤；随机多点取样5-10g，过2mm筛后，分装至2mL或更大体积的EP管或冻存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g。 | |
粪便 | 无菌牙签或粪便取样器截取样品中段内部（避免表层中的肠道膜脱落细胞），外部容易污染且细菌DNA由于接触空气可能有降解。将已取的粪便样品分装至2mL EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管粪便量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份。 | |
肠道内容物 | 在实验对象死亡后，无菌条件下，取出整个肠道，用无菌解剖刀切取所需肠段的，用无菌手术刀挖取内容物分装至2mL EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管组织量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份 | |
水体 | 过滤大量低微生物含量的清亮水样用0.22μm 的聚苯醚砜滤膜，每个样本至少1L水样。浑浊水样使用0.22μm滤膜过滤缓慢容易堵塞时，建议使用0.45μm的混合纤维素酯滤膜，每个样本0.5L-1L水样；如果水样中不可溶解的颗粒较多，需要使用2-5μm孔径的滤膜将不可溶解的颗粒杂质滤去，再使用0.22μm或0.45μm的滤膜富集菌体，每个样本0.5L-1L水样。 | |
空气 | 开动采样仪（浮游细菌采集器），使被测空气滤过凝胶膜（灭菌），空气中的浮游菌被截留在凝胶膜上（过滤时间越长，收集的空气中的灰尘越多，菌数量越多），收集完成后取下滤膜。 |
1、16S是什么？
16S rDNA是指细菌基因组中编码核糖体16S rRNA分子所对应的DNA序列，序列全长约1540bp，包含10个保守区和9个高变区（V1-V9）。保守区序列在细菌间差异不大而高变区则具有种属特异性，因此最常用作细菌分类标准。通过对环境样品的细菌总DNA进行提取，扩增其中16S rDNA基因，可以鉴定出绝大多数细菌类别。
2、为什么要选择做16S+代谢组学？
16S只是研究了肠道微生物的构成和组份的改变与宿主的生理以及人类的疾病相关。然而，肠道微生物对宿主的作用其中一方面贡献是通过肠道中微生物产生的小分子次级代谢产物，通过循环系统来作用于人体的各个部位，调控宿主体内的稳态，比如许多研究发现，肠道微生物的代谢产物对糖尿病、高血压、心脏病和抑郁、肠道的免疫等疾病都有影响。16S可以得到样本当中有哪些微生物，和预测他们的功能，而代谢组学研究代谢物的表达量、代谢物与生理病理变化的关系，能够帮助确定这些功能是否真的发生了，发生的程度是什么样的。两者的联用，可以通过代谢组结果的检测辅助和验证16S分析结果；两者的联合分析可以得到微生物多样性、种类、相对丰度与代谢物丰度的关联。
