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免疫荧光法（Immunofluorescence method）是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。
免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位。
免疫荧光检查样本的要求包括以下几个方面：
1.取材手法：要求取材器械锋利，尽可能选择薄的手术刀片，减少剪刀的使用，以避免挤压挫伤标本。取材时应尽量准确地取到目的部位组织，夹取标本时尽量远离目的区域组织。取材速度应尽量保证样本离体后5分钟内放入到合适的固定液内。如果一只动物同时取多种器官，应优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官（如脑、脊髓等），皮肤、肌肉等可放到最后取。
2.组织块大小：未经灌注的标本组织厚度不应超过1cm。对于细胞爬片，细胞密度应合适（最好是10^5），状态良好。细胞爬片一次应做完，保存不超过一周。如果细胞数量少，太少的爬片不要进行免疫荧光检测。
3.固定液：针对不同的标本特点及实验目的，一定要选用正确的固定液。组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18-24小时。
4.切片要求：对于石蜡切片，切片放置时间不能超过半年，否则存在抗原丢失的可能性，结果可能为阴性或阳性较低。切片厚度不应超过10um。对于冰冻切片，放置时间不能超过三个月，且应保存在-20℃。20um厚的冰冻切片容易掉片，而8-10um的切片则较为适宜。
请注意，这些要求可能会因实验室的具体条件和实验目的而有所不同。因此，在实际操作中，建议联系我们实验室的具体要求和指导，以确保样本的质量和准确性。
1.目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异不明显，可能造成假阴性结果。这可能是由于抗体不适用于特定的预处理组织，抗体修复不充分，或者抗体浓度不当等原因导致的。为了解决这个问题，需要确认抗体的适用性，优化抗体修复条件，以及调整抗体浓度。
2.信号弱或无信号，染色细胞过少。这可能是由于目标蛋白在细胞中没有表达，表达目标蛋白的细胞过少，细胞通透性差，抗原表位被破坏，抗体不识别，抗体稀释度过大，或者二抗选择错误等原因引起的。可以通过验证目标蛋白的表达，增加细胞数量，优化通透剂的使用，换用其他固定方法，调整抗体稀释度，或者选择正确的二抗来解决这个问题。
3.蛋白荧光太强，形成非特异性标记，导致背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果。这可能是由于抗体浓度过高，孵育时间过长，或者试剂质量等问题引起的。可以通过降低抗体浓度，缩短孵育时间，或者更换试剂来优化结果。
4.组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色。这可能是由于固定液选择不当，固定时间不足或过长，或者切片放置时间过长等原因引起的。需要优化组织切片预处理条件，选择合适的固定液和固定时间，以及确保切片的新鲜度。
