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利用Q Exactive（QE）质谱仪对多肽和蛋白质进行的高分辨率修饰位点鉴定。蛋白质大规模鉴定分析（Shotgun法）对蛋白质进行定性分析。将溶液内蛋白质分子或SDS-PAGE条带的复杂混合物酶解成肽段混合物，通过液相色谱（HPLC）分离，串联质谱（MS/MS）测试，最后用相应的数据库进行检索匹配，可同时鉴定成百上千种蛋白质的修饰情况。
修饰类型：
1、磷酸化
2、泛素化
3、乙酰化
4、甲基化
| shotgun鉴定 | 胶条 | 条带肉眼清晰可见 | 将需要鉴定的SDS-PAGE条带切下，装进EP管，常温或冰袋寄送，颜色非常浅的条带可取多个重复样本放一起 | 考染蛋白质全部接受，银染的蛋白质不得使用戊二醛作为固定剂 |
| 蛋白溶液 | 蛋白提取正常 | 用PEG管盛放提取的蛋白液，做好标记，干冰寄送 | 注明液体体系成份 |
蛋白质纯度：蛋白质样品中若含有较多杂质，将影响质谱仪对修饰位点的准确鉴定。因此，确保蛋白质样品的高纯度是实验成功的关键。
蛋白酶解：蛋白酶的选择和酶解条件对肽段的产生和修饰位点的暴露有重要影响。例如，胰蛋白酶是常用的蛋白酶，但不同的酶解条件（如酶解时间、酶与底物的比例等）将影响肽段的生成和后续分析。
分辨率和灵敏度：质谱仪的分辨率和灵敏度直接影响对修饰位点的检测能力。高分辨率质谱仪能够更准确地识别肽段和修饰基团，而高灵敏度则有助于检测低丰度的修饰肽段。
质谱方法选择：不同的质谱方法（如一级质谱、二级质谱等）对修饰位点的鉴定有不同的优势和局限性。二级质谱能够提供更多的结构信息，有助于准确鉴定修饰位点。
数据库比对：质谱数据需要与蛋白质数据库进行比对，以鉴定肽段和修饰位点。数据库的准确性和完整性对鉴定结果有重要影响。
修饰类型识别：不同的修饰类型（如磷酸化、乙酰化等）在质谱图上具有不同的特征。准确识别这些特征对于确定修饰类型至关重要。
假阳性与假阴性：由于质谱数据的复杂性和不确定性，数据分析过程中可能出现假阳性和假阴性结果。因此，在解释数据时需要注意这些潜在问题。
非常见修饰的富集方法：对于某些非常见或低丰度的修饰类型，其富集方法可能不太成熟或效率较低。这可能导致这些修饰类型在质谱图中难以被检测到。
修饰分子量偏差：由于质谱技术的限制，某些修饰可能导致分子量偏差过大或不确定，从而影响修饰位点的准确鉴定。
避免角蛋白污染：在质谱鉴定过程中，需要特别注意避免角蛋白污染。因为角蛋白可能会与样品中的蛋白质发生非特异性结合，影响实验结果。
使用去离子水或双蒸水：在样品处理和质谱分析过程中，应使用去离子水或双蒸水，以减少水中杂质对实验结果的影响。
1. 样品制备问题
2. 质谱仪器和条件
3. 数据分析与解释
4. 技术难点
5. 注意事项
综上所述，质谱鉴定蛋白质修饰位点过程中涉及多个环节和因素，需要综合考虑和注意。通过优化实验条件、选择合适的质谱方法和数据库、准确解释数据以及注意技术难点和注意事项，可以提高质谱鉴定蛋白质修饰位点的准确性和可靠性。
