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Label-free Quantitative Proteomics,即非标记的定量蛋白质组学,不需要对比较样本进行标记处理,只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的质谱信号强弱便可得到样品间蛋白表达量的变化。Label-free通常应用于多种组别大规模样本量的蛋白质组定量比较,也适应于无法用标记实现定量的实验设计。近年来,Label-free定量蛋白质组学技术已经成为一种非常重要的质谱定量方法,其基本技术路线如下图所示。
比较主流的Label-free定量蛋白质组学技术定量原理是以一级质谱为基础的,即计算每个蛋白中的特异性肽段在LC-MS上质谱响应信号的积分。通用软件MaxQuant的内嵌算法即基于这种原理
实验流程
功能注释流程
目录
部分结果图展示：
| 产品名称 | 样品类型 | 送样量 | 预处理和保存 |
| Label-free | 常规动物组织（脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤等） | ≥50 mg | PBS洗涤去除残留血液和污染物，迅速剥去脂肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净。用组织剪或手术刀将组织分离成1cm3左右的小块。液氮速冻，保存在-80°C，干冰运输 |
| 软体动物（血吸虫、旋毛虫等） | ≥200 mg | PBS洗涤去除来自宿主的污染。液氮速冻，保存在-80°C，干冰运输 | |
| 动物软骨组织 | ≥100 mg | PBS洗涤，用手术刀将软骨切成1cm3左右的小块。液氮速冻，保存在-80°C，干冰运输 | |
| 动物毛发 | ≥50 mg | 用适量2%SDS，50mM 磷酸钠（pH7.8）缓冲液漂洗样品，去除污染物，干燥，保存在-80°C，干冰运输 | |
| 柔软组织（木本植物的叶、花等，草本科植物，藻类，蕨类植物，大型真菌等） | ≥200 mg | 收集样品，液氮速冻（如果样品表面有泥土或明显污染物，则液氮速冻前用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体），保存在-80°C，干冰运输 | |
| 木本科植物的树根、树皮、树枝等 | ≥200 mg | 收集样品，液氮速冻（如果样品表面有泥土或明显污染物，则液氮速冻前用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体），保存在-80°C，干冰运输 | |
| 果实、种子 | ≥500 mg | 收集样品，液氮速冻（如果样品表面有泥土或明显污染物，则液氮速冻前用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体），保存在-80°C，干冰运输 | |
| 果肉 | ≥2 g | 去皮切成1cm3左右小块，液氮速冻，保存于-80°C，干冰运输 | |
| 花粉 | ≥200 mg | 植物开花期收集花粉，解剖显微镜下检查花粉，用解剖针去除花药碎片等杂质，转入EP管中，光学显微镜下检查花粉的形态和纯度。保存于-80°C，干冰运输 | |
| 细菌菌类 | ≥20 mg | 3000g-5000g离心5-15min，去上清，PBS洗涤沉淀三次，液氮速冻，菌体-80°C保存，干冰运输 | |
| 真菌菌体 | ≥2 g | PBS清洗，吸水纸吸去表面液体，液氮速冻，保存于-80°C，干冰运输 | |
| 悬浮培养细胞 | ≥5× 10^6 | 1)400g-1000g离心10分钟收获细胞，弃上清。 2)用预冷的PBS小心洗涤片状沉淀物2次，置于冰上，去上清。 3)液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 | |
| 贴壁培养细胞 | ≥5× 10^6 | 1)弃掉培养液，并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液 2) 加入4°C预冷的PBS，平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞，然后弃去PBS。 重复以上操作两次以洗去培养液。 3)将培养皿置于冰上。向培养皿内加入4°C预冷的PBS。用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），冰上斜置培养皿，使得缓冲液流向一侧。移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内。离心去上清。 4)液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 | |
| 血清 | ≥100 μL | 收集好的全血室温静置两小时，3000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 | |
| 血浆 | ≥100 μL | 收集好的全血加入抗凝剂，室温静止30分钟，1300g-2000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 | |
| 动物乳汁或人乳汁 | ≥1mL | 收集母乳，-80°C保存，干冰运输。若要去除样品中的高丰度酪蛋白，需要超速离心除去。 | |
| 乳脂肪球膜蛋白（MFGM），即脂质层 | ≥50 μL | 收集母乳，4度高速离心15min，取脂质层，用预冷的5倍体积的PBS洗涤3次，纯水洗涤一次，-80°C保存，干冰运输 | |
| 脑脊液、关节液、淋巴液、附睾腔液 | ≥100 μL | 1000g-2000g离心5min，（或使用0.22µm滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 | |
| 唾液 | ≥1 mL | 禁食两小时以上，9-12am取样，1000g-2000g离心5min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 | |
| 泪液 | ≥100 µL | 收集样品（可利用capillary micropipette或Schirmer strip），8000-14000g 4度 离心5min，取上清， -80°C保存，干冰运输 | |
| 尿液 | ≥5mL | 5000×g 4°C 离心30-60min，取上清， -80°C保存，干冰运输 | |
| 分泌蛋白 | ≥5 mL | 10000g-20000g离心30-60min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 | |
| 外泌体-细胞培养上清 | ≥50 mL | 10000g-20000g离心30-60min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 | |
| 外泌体-血清 | ≥5 mL | 收集好的全血室温静置两小时，3000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 | |
| 外泌体-血浆 | ≥5 mL | 收集好的全血加入抗凝剂，室温静止30分钟，1300g-2000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 | |
| 外泌体-尿液 | ≥100 mL | 5000×g 4°C 离心30-60min，取上清， -80°C保存，干冰运输 |
解答：Label-free定量技术的原理是基于质谱分析的信号强度与样品中蛋白质的丰度之间的相关性。肽段在质谱中被捕获检测的频率与其在混合物中的丰度成正相关，因此，通过比较质谱峰强度或谱图计数，可以反映蛋白质的丰度变化。
解答：Label-free定量技术主要分为两种方法：一种是基于LC-MS/MS的肽段母离子的峰面积（AUC，Area Under the Curve），另一种为谱图计数（Spectral Counting）。AUC方法使用实际色谱响应的离子流峰，结果相对更准确，因此是当前主流的方法。
解答：Label-free定量技术的主要优点包括无需对蛋白质进行标记，因此简化了实验步骤，减少了潜在的标记偏差；同时，该技术能够同时检测多个样品，提高了通量；此外，由于不依赖标记，Label-free方法更适用于临床样本等复杂体系的分析。
解答：Label-free定量技术的准确性取决于多个因素，包括质谱仪器的性能、样品制备的质量、数据分析的准确性等。通过优化实验条件和采用先进的数据处理算法，可以提高Label-free定量技术的准确性。
解答：Label-free定量技术广泛应用于蛋白质组学研究的各个领域，包括疾病生物标志物的发现、药物靶点的鉴定、蛋白质相互作用的研究等。该技术能够提供蛋白质表达水平的定量信息，有助于深入理解生物过程和疾病机制。
解答：虽然Label-free定量技术具有许多优点，但也存在一些限制。例如，该技术对质谱仪器的灵敏度和分辨率要求较高；同时，样品制备过程中可能存在的偏差也会影响定量结果的准确性。此外，Label-free定量技术可能不适用于所有类型的蛋白质，特别是那些低丰度或难以离子化的蛋白质。
非标定量蛋白组（Label-free）技术是一种在蛋白质组学研究中常用的方法，它不需要对蛋白质进行标记（如同位素标记）就能进行定量分析。这种技术基于质谱（MS）的分析，特别是液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术，通过对质谱峰强度或谱图计数的比较来分析不同来源样品蛋白的数量变化。以下是关于非标定量蛋白组（Label-free）技术检测蛋白的一些常见疑问及其解答：
1、Label-free定量技术的原理是什么？
2、Label-free定量技术有哪些主要方法？
3、Label-free定量技术有哪些优点？
4、Label-free定量技术的准确性如何？
5、Label-free定量技术有哪些应用？
6、Label-free定量技术有哪些限制？
