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线粒体基因组De novo测序是一种基因组学研究方法，用于确定线粒体DNA（mtDNA）的完整序列，特别是在该物种的线粒体基因组序列未知或仅有部分信息的情况下。这种方法通常被称为“从头测序”（De novo sequencing）。
以下是线粒体基因组De novo测序的一般步骤：
样本准备：首先，需要收集并准备含有线粒体DNA的样本。这可以是细胞、组织或其他生物材料。
DNA提取：从样本中提取线粒体DNA。这通常需要使用特定的试剂和方法来分离和纯化线粒体DNA。
测序：然后，使用高通量测序技术（如下一代测序技术）对线粒体DNA进行测序。这将产生大量的序列数据，涵盖线粒体基因组的所有区域。
数据分析和组装：测序产生的数据需要经过一系列的处理和分析步骤，包括质量控制、序列拼接和组装等，以得到线粒体基因组的完整序列。
注释和验证：最后，对组装好的线粒体基因组进行注释，识别并标记出基因、调控元件等重要的功能区域。同时，可能还需要通过其他实验方法来验证测序结果的准确性。
线粒体基因组De novo测序对于研究线粒体DNA的遗传变异、线粒体功能、物种进化等方面具有重要意义。例如，它可以用于识别线粒体疾病的致病突变，分析物种间的进化关系，以及研究线粒体在细胞代谢和能量生成中的作用等。
实验流程
分析流程
典型结果展示
eggNOG 数据库功能注释分类图
GO 数据库功能注释分类图
KEGG 注释通路例图
样品全基因组图谱
全基因组结构变异类型配对图
物种间的进化关系图
| 样品类型 | 送样量 | 预处理和保存 |
| 动物组织 | ≥500 mg | 1) 无酶冻存管，液氮中预冷； 2) 活体上迅速取下组织（切成黄豆粒大小的块状）； 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水快速清洗组织表面的污渍，吸干表面液体后收集进冻存管（管的下部分保持在液氮中）； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存，避免反复冻融； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 植物表面组织、植物根部,茎，叶子 | ≥2 g | 1) 无酶冻存管，液氮中预冷； 2) 尽量选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位，若为体积偏大的样本（如果实），尽量切成小块； 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水快速清洗组织表面的附着物，吸干表面液体后收集进冻存管（管的下部分保持在液氮中）； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存，避免反复冻融； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 植物嫩叶片、嫩芽 | ≥500 mg | 1) 无酶冻存管，液氮中预冷； 2) 尽量选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位，若为体积偏大的样本（如果实），尽量切成小块； 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水快速清洗组织表面的附着物，吸干表面液体后收集进冻存管（管的下部分保持在液氮中）； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存，避免反复冻融； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 培养细胞 | ≥1*10^7 | 1) 取生长状态良好细胞，确定细胞数量； 2) 贴壁细胞：用1×PBS缓冲液洗涤细胞 1-2 次； 悬浮细胞：离心，吸除细胞培养液，1×PBS洗涤，离心弃PBS，洗1-2次； 3) 加入适量Trizol裂解液反复吹打至裂解充分； 4) 转移至无酶离心管中，-80 ℃保存； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 血液样品 | ≥250 μL | 1) 使用抗凝采血管采集全血； 2) 轻轻倒转采血管混合4-5次，使抗凝剂与血液混匀； 3) 快速转移至单独的冻存管中，按照250μl/管分装，加750μl Trizol LS混匀； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 真菌菌丝体 | ≥600 mg | 1) 将真菌称重（每管200mg），分装多管，请提供不少于3管的菌丝体； 2) 将称重分装后的真菌置于液氮中冷冻≥1h； 3) 转移至-80 ℃保存； 4) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| RNA样本 | 1.总量≥2 μg，浓度≥50 ng/μL， 2. OD260/OD280在1.8-2.2之间，RNA无降解，28/23S（真核/原核）和18/16S（真核/原核）核糖体RNA条带非常亮且清晰，Aglient 2100检测仪分析RNA完整性数据RIN≥8 | 1） total RNA可以保存在焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明； 2）无蛋白质、基因组DNA污染，如有污染请去蛋白并进行DNase I处理； 3）避免反复冻融，应对total RNA小量分装； 4） 样品请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
1.是否需要纯的线粒体DNA进行测序？
不需要。实际上，对于线粒体基因组测序，通常可以提供全基因组总DNA，而不需要通过密度梯度离心等方法获得纯的线粒体DNA。这是因为一个真核生物中包含多个线粒体，每一个线粒体中包含多条线粒体基因组DNA。因此，即使从全基因组总DNA中提取，线粒体基因组DNA仍然可以被有效地测序。
2.如何从全基因组测序中获得线粒体DNA？
在全基因组测序中，线粒体基因组DNA通常可以通过生物信息学分析获得。这包括将全基因组拼接结果中高覆盖度的序列提取出来，并与数据库进行比对分析，从而获得线粒体基因组DNA。
3.线粒体基因组的大小和结构如何影响测序？
线粒体基因组通常是环状的，并且大小在不同物种之间有所差异。这种环状结构可能会对测序结果产生一些影响，例如，对于比对软件来说，可能会造成“半截比对”的现象，即只能选择头或尾其中一个位置。因此，在分析线粒体基因组数据时，需要考虑这种结构特点。
4.线粒体DNA与核基因的同源问题如何影响测序？
线粒体DNA（mtDNA）与核基因（nuMTs）之间存在同源相似区，部分同源区的相似程度可达100%。这可能会在全基因组比对时造成一定程度的困扰，因为随着读长、测序模式的不同，可能会造成不同程度的覆盖率缺失，从而影响后续的突变寻找。
5.线粒体基因组测序的样品如何准备？
对于线粒体基因组测序的样品准备，通常需要收集并准备含有线粒体DNA的样本，如细胞或组织。对于植物来说，由于线粒体/叶绿体基因组大小比较大，可能需要采用特定的测序方法，如Illumina+Pacbio，并可能需要提供富集的线粒体DNA。常用的富集方法包括超高速离心富集和使用富集线粒体/叶绿体DNA试剂盒等。
