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外泌体是细胞外囊泡（EVs）的主要亚类之一，几乎所有类型的细胞都会分泌外泌体，广泛存在于体液中。它们可以携带特定的信号分子介导细胞间通讯，调节受体细胞的生理和病理状态，参与多种疾病的发生和发展。因此，外泌体可作为某些疾病的诊断生物标志物。最近，基于外泌体的无细胞疗法引起了医学界的极大兴趣，外泌体作为药物递送系统的研究也引起了许多研究人员的极大关注。
外泌体的主要分离提取技术
超速离心是分离不同生物成分最常用的方法，被认为是外泌体分离的经典方法。可分为密度梯度超速离心和差速超速离心（DUC）。
1.1差速超速离心
DUC 是最早和最常报道的外泌体分离策略。操作步骤如下图所示。该方法过程简单，不引入其他标记，适用于大剂量样品分析。然而，鉴于细胞外液具有高度异质性，DUC 可导致非理想的外泌体聚集; 因此，它可能不是一种合适的外泌体纯化方法，因为大小相似的不同囊泡和蛋白质聚集体可以在 100,000 × g 下共同形成。因此，应进一步纯化使用该方法制备的外泌体。此外，离心力会导致外泌体结构的破坏，进而影响下游实验，特别是外泌体的功能分析。
基于差速超速离心的外泌体分离示意图。差速超速离心是通过离心力在 300 × g 到 100,000 × g 范围内的多循环离心来进行的。通过控制不同的离心力和时间段，依次去除细胞、细胞碎片和凋亡小体。最后一次离心（即 100,000 × g）后，通过去除上清液收集外泌体。离心机在 4 °C 下运行。
基于差速超速离心的外泌体分离示意图。差速超速离心是通过离心力在 300 × g 到 100,000 × g 范围内的多循环离心来进行的。通过控制不同的离心力和时间段，依次去除细胞、细胞碎片和凋亡小体。最后一次离心（即 100,000 × g）后，通过去除上清液收集外泌体。离心机在 4 °C 下运行。
1.2密度梯度超速离心
密度梯度超速离心是一种基于DUC的改进技术，它是将样品颗粒加入具有密度梯度的惰性介质（如蔗糖和氯化铯）中，从而利用颗粒密度与媒介。不同的粒子在一定的相对离心力的作用下，集中在梯度介质中的特定位置。最后，获得不同的区域，以便可以从不同的区域收集各种高纯度颗粒。该方法适用于沉降系数略有差异的颗粒的分离。鉴于不同细胞外成分之间固有的密度差异，使用该方法可以获得更纯化的外泌体 。步骤如下图所示。
基于梯度密度超速离心的外泌体分离示意图。A等密度密度梯度超速离心。B移动区梯度超速离心。该技术可以分离沉降系数较差的颗粒，如DUC，也可以分离具有一定密度差的颗粒。粒子保持活性，不会挤压或变形。基于梯度密度超速离心的外泌体分离示意图。A等密度密度梯度超速离心。B移动区梯度超速离心。该技术可以分离沉降系数较差的颗粒，如DUC，也可以分离具有一定密度差的颗粒。粒子保持活性，不会挤压或变形。
2.超滤 (UF)——被动隔离方法
UF 的主要原理涉及使用具有指定孔径或截留分子量 (MWCO) 的膜来分离预定尺寸范围内的颗粒。因此，它是一种基于尺寸的隔离技术。基于这一原理，两种类型的超滤装置得到了很好的发展：串联配置的超滤和顺序超滤。外泌体回收率取决于过滤器的类型。在之前的研究中，观察到孔径为 10 kDa 的纤维素膜具有最高的回收效率 。UF 可以大大缩短处理时间并且不需要特殊设备。
基于超滤的外泌体分离示意图。串联配置的超滤。当生物流体通过两层膜时，包括细胞碎片、凋亡小体和细胞在内的大囊泡被困在 200 nm 的膜中，而直径在 20-200 nm 范围内的囊泡则保留在下方 20 nm筛选。B连续超滤。较大的颗粒（例如，细胞或细胞碎片）首先通过 1000 nm 过滤器去除；然后将滤液通过第二个过滤器，截留值为 500-kD，以去除游离蛋白质；最后，通过 200 nm 过滤器从滤液中收集直径在 50-200 nm 范围内的外泌体。
3.体积排阻色谱法 (SEC)——被动分离方法
SEC 使用初始生物流体作为流动相，使用多孔凝胶过滤聚合物作为固定相。固定相的性质允许不同的洗脱：首先洗脱较大的颗粒。它们之后是较小的囊泡，然后是非膜结合蛋白（因为较大的颗粒可以通过较少的孔，它们通过较短的路径到达柱的末端并更快地洗脱）。因此，不同阶段的洗脱液含有不同大小的颗粒。
| 血浆/血清3-5ml | |
| 细胞上清>200ml | |
| EV>0.5mg |
外泌体是什么？
外泌体是一种由细胞释放到细胞外空间的纳米级囊泡，携带了来自母细胞的蛋白质、mRNA、miRNA等生物活性物质。它们在细胞间通讯、免疫调节、疾病诊断与治疗等领域具有广泛的应用前景。外泌体提取的方法有哪些？
外泌体提取的方法包括超速离心法、密度梯度离心、超滤离心、磁珠免疫法、聚合物沉淀法以及试剂盒提取等。每种方法都有其优缺点，选择哪种方法取决于实验的具体需求，如外泌体的纯度、数量以及后续实验的要求等。如何保证外泌体的纯度？
保证外泌体的纯度是提取过程中的关键。可以通过优化提取方法、使用高纯度的试剂和器材、严格控制实验条件等方式来提高外泌体的纯度。此外，对提取出的外泌体进行鉴定和质量控制也是非常重要的步骤。外泌体提取后如何保存？
外泌体提取后应尽快进行后续实验，以保证其生物活性和稳定性。如果需要暂时保存，可以将外泌体保存在适当的温度（如4°C）下，并避免反复冻融。长期保存则建议采用冷冻方式，并在冷冻前加入适量的保护剂以减少冷冻对外泌体的损伤。外泌体提取过程中需要注意什么？
在外泌体提取过程中，需要注意避免外泌体的污染和损失。同时，要严格控制实验条件，如温度、pH值等，以保证外泌体的完整性和生物活性。此外，对于涉及生物安全性的实验，还需要注意遵守相关的生物安全规定和操作流程。
外泌体提取是一个复杂且精细的过程，涉及多个步骤和注意事项。以下是一些关于外泌体提取的常见疑问及其解答：
