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转录组测序（RNA-Seq）
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转录组测序（RNA-Seq）是一种利用新一代高通量测序技术进行cDNA测序的技术，能够全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。它反映了mRNA、smallRNA、noncodingRNA等或者其中一些的表达水平。
转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。这种测序技术无需预先设计探针，即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测，并且能提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围。
在测序建库的过程中，会选择不同的片段大小，以适应不同的测序对象。例如，mRNA测序时，通常会选择200-300 bp大小的片段进行建库，并采用125PE/150PE测序。而对于长链非编码RNA（lncRNA），由于存在正向转录和反向转录，因此常采用去除rRNA后进行链特异性建库测序的原则。
转录组测序技术已被广泛应用于各物种的基础研究、临床诊断和药物研发等领域。例如，在基础研究中，它可用于研究基因功能及结构，揭示特定的生物学过程；在临床诊断中，可用于疾病的早期诊断、病情监测和预后评估；在药物研发中，可用于新药的发现和药物作用机制的研究。
| 样品类型 | 送样量 | 预处理和保存 |
| 动物组织 | ≥500 mg | 1) 无酶冻存管，液氮中预冷； 2) 活体上迅速取下组织（切成黄豆粒大小的块状）； 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水快速清洗组织表面的污渍，吸干表面液体后收集进冻存管（管的下部分保持在液氮中）； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存，避免反复冻融； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 植物表面组织、植物根部,茎，叶子 | ≥2 g | 1) 无酶冻存管，液氮中预冷； 2) 尽量选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位，若为体积偏大的样本（如果实），尽量切成小块； 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水快速清洗组织表面的附着物，吸干表面液体后收集进冻存管（管的下部分保持在液氮中）； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存，避免反复冻融； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 植物嫩叶片、嫩芽 | ≥500 mg | 1) 无酶冻存管，液氮中预冷； 2) 尽量选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位，若为体积偏大的样本（如果实），尽量切成小块； 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水快速清洗组织表面的附着物，吸干表面液体后收集进冻存管（管的下部分保持在液氮中）； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存，避免反复冻融； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 培养细胞 | ≥1*10^7 | 1) 取生长状态良好细胞，确定细胞数量； 2) 贴壁细胞：用1×PBS缓冲液洗涤细胞 1-2 次； 悬浮细胞：离心，吸除细胞培养液，1×PBS洗涤，离心弃PBS，洗1-2次； 3) 加入适量Trizol裂解液反复吹打至裂解充分； 4) 转移至无酶离心管中，-80 ℃保存； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 血液样品 | ≥250 μL | 1) 使用抗凝采血管采集全血； 2) 轻轻倒转采血管混合4-5次，使抗凝剂与血液混匀； 3) 快速转移至单独的冻存管中，按照250μl/管分装，加750μl Trizol LS混匀； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 真菌菌丝体 | ≥600 mg | 1) 将真菌称重（每管200mg），分装多管，请提供不少于3管的菌丝体； 2) 将称重分装后的真菌置于液氮中冷冻≥1h； 3) 转移至-80 ℃保存； 4) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| RNA样本 | 1.总量≥2 μg，浓度≥50 ng/μL， 2. OD260/OD280在1.8-2.2之间，RNA无降解，28/23S（真核/原核）和18/16S（真核/原核）核糖体RNA条带非常亮且清晰，Aglient 2100检测仪分析RNA完整性数据RIN≥8 | 1） total RNA可以保存在焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明； 2）无蛋白质、基因组DNA污染，如有污染请去蛋白并进行DNase I处理； 3）避免反复冻融，应对total RNA小量分装； 4） 样品请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
转录组测序（RNA-Seq）是一种强大的技术，能够全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本的信息。以下是一些关于转录组测序的常见疑问及其解答：
1.什么是转录组测序？
转录组测序是一种利用新一代高通量测序技术，对特定细胞或组织在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA进行测序的方法。它可以提供mRNA、非编码RNA等的表达水平信息。
2.为什么进行转录组研究而不是基因组研究？
转录组研究关注的是基因的表达情况，即哪些基因在特定条件下被转录成mRNA。而基因组研究则关注基因的序列和结构。转录组研究可以更直接地反映生物体的功能状态和生理过程，因此在很多情况下更为有用。
3.转录组测序可以同时检测mRNA、miRNA及其他非编码RNA吗？
是的，转录组测序可以同时检测mRNA、miRNA以及其他非编码RNA。这种技术可以对整个转录组进行全面的分析，包括不同类型的RNA分子。
4.测序深度和覆盖度是什么意思？
测序深度指的是测序得到的总读数或测序数据量，而覆盖度则指的是测序数据对基因组的覆盖程度。测序深度和覆盖度是影响转录组测序结果的关键因素，需要根据具体实验需求进行选择。
5.Q20、Q30所代表的碱基质量含义是什么？
Q20和Q30是评估测序数据质量的重要指标。Q20表示测序错误率为1%，即每个碱基的测序准确性达到99%；Q30表示测序错误率为0.1%，即每个碱基的测序准确性达到99.9%。这些指标可以帮助研究人员评估测序数据的质量和可靠性。
6.Paired-end与Single-end表示什么意思？
Paired-end和Single-end是两种不同的测序策略。Paired-end测序是指从样品的两端分别进行测序，得到成对的末端读数，可以用于确定转录本的结构和剪接位点；而Single-end测序则只从样品的一端进行测序，得到单一的读数。
7.原核生物与真核生物在进行转录组测序文库构建时有什么区别？
原核生物和真核生物在转录组测序文库构建时的主要区别在于RNA的提取和纯化方法。原核生物的RNA通常较为稳定，可以直接提取；而真核生物的RNA则存在较多的修饰和剪接现象，需要进行更复杂的处理和分析。
8.转录组测序一定要设置生物学重复吗？如果样品间差异不大还需要设置吗？
设置生物学重复可以提高转录组测序的准确性和可靠性，但并不是必须的。如果样品间差异不大或者实验条件非常稳定，可以不设置生物学重复。然而，为了获得更可靠的结果，建议尽可能设置生物学重复。
9.转录组测序对样品有什么要求吗？样品用量是多少？
转录组测序对样品的要求因实验类型和物种而异。一般而言，样品应该是高质量的RNA，且数量足够进行测序。具体的样品用量取决于实验设计和测序平台的要求。
10.样品该如何收集与处理？
样品的收集和处理方法因实验类型和物种而异。一般来说，需要确保样品在收集过程中不受污染和损伤，并尽快进行处理以防止RNA的降解。处理过程中可能需要进行RNA的提取、纯化和质量控制等步骤。
以上是一些关于转录组测序的常见疑问及其解答。当然，随着技术的不断发展和应用领域的拓展，还可能出现更多新的问题和挑战。因此，在使用转录组测序技术进行研究时，建议与我们的实验人员或研究人员进行充分沟通和讨论，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。
