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长链非编码RNA测序（lncRNA-seq）
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lncRNA测序是一种研究长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）差异表达如何影响生物学过程的技术。长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，它们通过与DNA、RNA或蛋白质结合，在表观遗传、转录及转录后等水平调控基因表达。lncRNA测序采用Illumina测序平台进行测序，可以针对有参考基因组样本开展准确的lncRNA鉴定和lncRNA靶基因预测，同时提供针对测序数据中mRNA的分析。
lncRNA测序的优势在于其可以同时获得mRNA和lncRNA的数据，甚至能获取circRNA的数据，而且使用链特异性建库方式，使得结果更全面，广泛应用于医学、农学研究领域。通过lncRNA测序，可以快速获得已知lncRNA和新的lncRNA及其靶标的相关信息，从而促进lncRNA的深入研究。
lncRNA测序的实验流程包括样品制备、文库构建、上机测序和数据分析等步骤。数据分析是lncRNA测序的核心环节，包括序列组装、基因注释、功能分析等多个步骤。通过对测序数据进行组装和注释，可以获得环境样品中微生物群体的基因组信息，包括基因组成、功能基因、代谢途径等。进一步的功能分析可以揭示微生物群体在环境中的作用和互作关系。
| 样品类型 | 送样量 | 预处理和保存 |
| 动物组织 | ≥500 mg | 1) 无酶冻存管，液氮中预冷； 2) 活体上迅速取下组织（切成黄豆粒大小的块状）； 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水快速清洗组织表面的污渍，吸干表面液体后收集进冻存管（管的下部分保持在液氮中）； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存，避免反复冻融； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 植物表面组织、植物根部,茎，叶子 | ≥2 g | 1) 无酶冻存管，液氮中预冷； 2) 尽量选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位，若为体积偏大的样本（如果实），尽量切成小块； 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水快速清洗组织表面的附着物，吸干表面液体后收集进冻存管（管的下部分保持在液氮中）； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存，避免反复冻融； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 植物嫩叶片、嫩芽 | ≥500 mg | 1) 无酶冻存管，液氮中预冷； 2) 尽量选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位，若为体积偏大的样本（如果实），尽量切成小块； 3) RNase-free水配制1×PBS或生理盐水快速清洗组织表面的附着物，吸干表面液体后收集进冻存管（管的下部分保持在液氮中）； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存，避免反复冻融； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 培养细胞 | ≥1*10^7 | 1) 取生长状态良好细胞，确定细胞数量； 2) 贴壁细胞：用1×PBS缓冲液洗涤细胞 1-2 次； 悬浮细胞：离心，吸除细胞培养液，1×PBS洗涤，离心弃PBS，洗1-2次； 3) 加入适量Trizol裂解液反复吹打至裂解充分； 4) 转移至无酶离心管中，-80 ℃保存； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 血液样品 | ≥250 μL | 1) 使用抗凝采血管采集全血； 2) 轻轻倒转采血管混合4-5次，使抗凝剂与血液混匀； 3) 快速转移至单独的冻存管中，按照250μl/管分装，加750μl Trizol LS混匀； 4) 液氮速冻（≥1h）后，转移至-80 ℃保存； 5) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| 真菌菌丝体 | ≥600 mg | 1) 将真菌称重（每管200mg），分装多管，请提供不少于3管的菌丝体； 2) 将称重分装后的真菌置于液氮中冷冻≥1h； 3) 转移至-80 ℃保存； 4) 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
| RNA样本 | 1.总量≥2 μg，浓度≥50 ng/μL， 2. OD260/OD280在1.8-2.2之间，RNA无降解，28/23S（真核/原核）和18/16S（真核/原核）核糖体RNA条带非常亮且清晰，Aglient 2100检测仪分析RNA完整性数据RIN≥8 | 1） total RNA可以保存在焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明； 2）无蛋白质、基因组DNA污染，如有污染请去蛋白并进行DNase I处理； 3）避免反复冻融，应对total RNA小量分装； 4） 样品请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。 |
在进行lncRNA测序时，需要注意以下几点：
1. 样品准备至关重要，应确保组间样本表型差异显著，组内样本一致性要好。样品的质量直接影响到测序数据的准确性和可靠性，因此样品准备过程中需要注意避免污染、RNA降解等问题。
2. 在选择测序方法时，应根据自己的需求进行选择。对于模式物种和非新发现的lncRNA，芯片是优先选择。而对于新物种或新发现的lncRNA，二代测序则是更好的选择。
3. 在验证阶段，先用筛选的样本进行验证，验证合格的再扩大样本验证。优先选择表达差异显著的lncRNA进行验证，长度建议为2kb左右。此外，细胞定位也有助于后续从转录组水平研究lncRNA的功能。
4. 需要注意lncRNA测序前的注意事项，如必须有转录组，且参考基因组组装水平及注释信息完善，至少为scaffold水平。同时，需要有适用的去rRNA试剂盒，以确保rRNA去除效果不佳不会严重影响数据质量。
