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DIA定量蛋白组学
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DIA定量蛋白质组学
数据非依赖性采集( Data Independent Acquisition，DIA)定量技术，将整个质谱的扫描质量范围分为若干窗口，依次对每个窗口的所有离子进行碎裂，采集全部子离子信息。利用业内顶尖的商业化DIA分析软件Spectronaut比对预先建立的谱图库即可实现定性确证和定量离子筛选。DIA是一种真正全景式、高通量的质谱技术，大大提高了定量的重现性、稳定性和准确性,同时也可实现数据回溯分析。
DIA具有以下特点：
(1) 无歧视地获得所有肽段的信息,不会造成低丰度蛋白信息的丢失,
(2) 循环时间固定,扫描点数均匀,定量准确度高,
(3) 肽段的选择没有随机性,数据可以回溯,对于复杂蛋白样本,特别是低丰度蛋 白具有更优异的重现性。
与传统质谱定量“金标准”选择反应监测 / 多反应监测(SRM/MRM)相比,DIA具有以下特点：
(1) 无需提前指定目标 肽段,适用于未知蛋白分析;
(2) 无需优化方法,获得数据后再基于谱图库实现定性确证和定量离子筛选;
(3) 通量无上限,适合大 规模蛋白定量分析。
项目实验流程
非标记定量蛋白质组学研究的主要步骤包括： 蛋白质提取、蛋白质定量、蛋白质酶解、 LC-MS/MS 分析、数据库检索、数据分析和实验报告等。
部分分析结果图展示
iRT 肽段（校正肽段）的洗脱时间
XvsX 蛋白质丰度比分布图
样品 PCA 得分图
XvsX 比较组火山图
XvsX 聚类分析结果
XvsX 比较组 GO 富集统计图
KEGG 信号通路注释示例
XvsX 比较组 KEGG 富集通路统计
XvsX 比较组差异表达蛋白质相互作用网络结果示例
| 样品类型 | 送样量 | 预处理和保存 |
| 常规动物组织（脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤等） | ≥30 mg | PBS洗涤去除残留血液和污染物，迅速剥去脂肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净。用组织剪或手术刀将组织分离成1cm3左右的小块。液氮速冻，保存在-80°C，干冰运输 |
| 软体动物（血吸虫、旋毛虫等） | ≥200 mg | PBS洗涤去除来自宿主的污染。液氮速冻，保存在-80°C，干冰运输 |
| 动物软骨组织 | ≥100 mg | PBS洗涤，用手术刀将软骨切成1cm3左右的小块。液氮速冻，保存在-80°C，干冰运输 |
| 动物毛发 | ≥50 mg | 用适量2%SDS，50mM 磷酸钠（pH7.8）缓冲液漂洗样品，去除污染物，干燥，保存在-80°C，干冰运输 |
| 柔软组织（木本植物的叶、花等，草本科植物，藻类，蕨类植物，大型真菌等） | ≥50 mg | 收集样品，液氮速冻（如果样品表面有泥土或明显污染物，则液氮速冻前用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体），保存在-80°C，干冰运输 |
| 木本科植物的树根、树皮、树枝等 | ≥2 g | 收集样品，液氮速冻（如果样品表面有泥土或明显污染物，则液氮速冻前用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体），保存在-80°C，干冰运输 |
| 果实、种子 | ≥200 mg | 收集样品，液氮速冻（如果样品表面有泥土或明显污染物，则液氮速冻前用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体），保存在-80°C，干冰运输 |
| 果肉 | ≥2 g | 去皮切成1cm3左右小块，液氮速冻，保存于-80°C，干冰运输 |
| 花粉 | ≥10 mg | 植物开花期收集花粉，解剖显微镜下检查花粉，用解剖针去除花药碎片等杂质，转入EP管中，光学显微镜下检查花粉的形态和纯度。保存于-80°C，干冰运输 |
| 细菌菌类 | ≥20 mg | 3000g-5000g离心5-15min，去上清，PBS洗涤沉淀三次，液氮速冻，菌体-80°C保存，干冰运输 |
| 真菌菌体 | ≥2 g | PBS清洗，吸水纸吸去表面液体，液氮速冻，保存于-80°C，干冰运输 |
| 悬浮培养细胞 | ≥1*10^7 | 1)400g-1000g离心10分钟收获细胞，弃上清。 2)用预冷的PBS小心洗涤片状沉淀物2次，置于冰上，去上清。 3)液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 贴壁培养细胞 | ≥1*10^7 | 1)弃掉培养液，并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液 2) 加入4°C预冷的PBS，平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞，然后弃去PBS。 重复以上操作两次以洗去培养液。 3)将培养皿置于冰上。向培养皿内加入4°C预冷的PBS。用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），冰上斜置培养皿，使得缓冲液流向一侧。移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内。离心去上清。 4)液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 血清 | ≥50 μL | 收集好的全血室温静置两小时，3000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 血浆 | ≥50 μL | 收集好的全血加入抗凝剂，室温静止30分钟，1300g-2000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 动物乳汁或人乳汁 | ≥1mL | 收集母乳，-80°C保存，干冰运输。若要去除样品中的高丰度酪蛋白，需要超速离心除去。 |
| 乳脂肪球膜蛋白（MFGM），即脂质层 | ≥50 μL | 收集母乳，4度高速离心15min，取脂质层，用预冷的5倍体积的PBS洗涤3次，纯水洗涤一次，-80°C保存，干冰运输 |
| 脑脊液、关节液、淋巴液、附睾腔液 | ≥20 μL | 1000g-2000g离心5min，（或使用0.22µm滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 |
| 唾液 | ≥50 μL | 禁食两小时以上，9-12am取样，1000g-2000g离心5min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 |
| 泪液 | ≥100 μL | 收集样品（可利用capillary micropipette或Schirmer strip），8000-14000g 4度 离心5min，取上清， -80°C保存，干冰运输 |
| 尿液 | ≥5 mL | 5000×g 4°C 离心30-60min，取上清， -80°C保存，干冰运输 |
| 分泌蛋白-细胞分泌液 | ≥2 mL | 10000g-20000g离心30-60min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 |
| 分泌蛋白-脑组织分泌液 | ≥2 mL | 10000g-20000g离心30-60min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 |
| 分泌蛋白-间质液 | ≥50 μL | 样品收集，-80°C保存，干冰运输 |
| 外泌体-血清 | ≥2 mL | 收集好的全血室温静置两小时，3000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 外泌体-血清 | ≥2 mL | 收集好的全血加入抗凝剂，室温静止30分钟，1300g-2000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 外泌体-尿液 | ≥30 mL | 5000×g 4°C 离心30-60min，取上清， -80°C保存，干冰运输 |
| IP样品 | ≥20 μg | 样品洗脱时，建议采取酸性洗脱模式，wash buffer中不建议含有去垢剂（SDS,NP-40,Triton-X100）,若需要使用去垢剂作为洗脱溶液，则需要采用SDS-PAGE对样本进行预处理，送样前，迅速液氮中速冻，并保存于-80°C中，干冰运输 |
DIA定量蛋白组学测试是一种蛋白质组学技术，用于对生物样品中的蛋白质进行定量分析。这种技术基于质谱（MS）和液相色谱（LC）等技术，具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，因此在生物学、医学等领域得到了广泛应用。在进行DIA定量蛋白组学测试时，可能会遇到一些常见的问题，下面是一些可能的问题及其解答：
1、什么是DIA定量蛋白组学测试？
DIA定量蛋白组学测试是一种基于质谱的定量蛋白质组学技术，它利用数据独立获取分析（DIA）的方法，对生物样品中的蛋白质进行定性和定量分析。与传统的基于标记的定量蛋白质组学技术相比，DIA技术不需要对样品进行标记，因此可以同时分析多个样品，并且具有更高的灵敏度和分辨率。
2、DIA定量蛋白组学测试的原理是什么？
DIA定量蛋白组学测试的原理基于质谱和液相色谱等技术。在测试中，首先将生物样品进行酶解，得到肽段混合物。然后，将肽段混合物通过液相色谱分离，进入质谱仪进行检测。在质谱仪中，肽段被离子化后，通过电场和磁场的作用，按照质荷比（m/z）进行分离和检测。通过对比不同样品中肽段的信号强度，可以对蛋白质进行定量分析。
3、DIA定量蛋白组学测试有哪些优点？
DIA定量蛋白组学测试具有以下优点：
（1）高通量：可以同时分析多个样品，提高了分析效率。
（2）高灵敏度：可以检测到低丰度的蛋白质。
（3）高分辨率：可以对蛋白质进行精确的定性和定量分析。
（4）无需标记：不需要对样品进行标记，避免了标记引入的实验误差。
4、DIA定量蛋白组学测试需要注意哪些问题？
在进行DIA定量蛋白组学测试时，需要注意以下问题：
（1）样品制备：样品制备是DIA定量蛋白组学测试的关键步骤之一。样品的质量和处理方法对测试结果有很大影响，因此需要注意样品的保存、处理和酶解等步骤。
（2）数据解析：DIA定量蛋白组学测试产生的数据量很大，需要进行复杂的数据解析。因此，需要选择合适的数据解析软件和方法，以确保数据的准确性和可靠性。
（3）定量准确性：虽然DIA定量蛋白组学测试具有高灵敏度和高分辨率，但仍然需要注意定量准确性问题。例如，样品的复杂性、质谱仪的稳定性等因素都可能影响定量准确性。因此，需要采取一系列措施来确保定量准确性，例如使用内参蛋白、进行重复实验等。
（4）数据分析：DIA定量蛋白组学测试产生的数据需要进行深入的分析和解释。因此，需要具备相关的生物信息学知识和技能，以便对数据进行有效的分析和解读。
