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TMT定量蛋白组学
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标记定量蛋白质组学（Quantitative Proteomics by TMT）
TMT是由Thermo Scientific公司研发出来的一种试剂，有两种不同的多标组合试剂，非标为TMT6标和TMT10标。TMT试剂是由三部分组成：报告基团（6标实验相对分子质量分别为126、127、128、129、130和131；10标实验相对分子质量分别为126、127N、127C 、128N、128C 、129N、129C 、130N、130C 和131），质量平衡基团和肽反应标记试剂基团。
在串联质谱分析中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，带不同同位素标签的同一多肽产生4种或8种不同质量的报告离子，根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。近年来，TMT定量蛋白质组学技术已经成为一种非常重要的质谱定量方法，其基本技术路线如下图
项目实验流程
TMT标记定量蛋白质组学项目的主要步骤包括：蛋白质提取、蛋白质定量、蛋白质酶解、肽段TMT标记、LC-MS/MS分析、数据库检索、数据分析和实验报告等。
本项目流程分为预备实验和正式实验两部分：预备实验包括蛋白质提取、蛋白质定量、SDS-PAGE凝胶电泳、蛋白质酶解、质谱分析、数据库查询、质量控制以及出具预备实验报告等步骤；正式实验是在预备实验的基础上进行的，对预备实验中质控合格的样本继续进行肽段TMT标记、肽段分级以及采用高分辨质谱仪进行LC-MS/MS检测，对获得的质谱数据进行数据分析并出具正式实验报告。
功能注释
基因本体（Gene Ontology）是一个标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准化词汇表，并以此从三个方面描述生物体中基因和基因产物的属性：参与的生物过程（Biological Process），分子功能（Molecular Function）和细胞组分（Cellular Component）。通常情况下，对目标蛋白集合的GO功能注释的步骤和流程大致可以归纳如下图：
部分结果展示
| 样品类型 | 送样量 | 预处理和保存 |
| 常规动物组织（脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤等） | ≥50 mg | PBS洗涤去除残留血液和污染物，迅速剥去脂肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净。用组织剪或手术刀将组织分离成1cm3左右的小块。液氮速冻，保存在-80°C，干冰运输 |
| 软体动物（血吸虫、旋毛虫等） | ≥500 mg | PBS洗涤去除来自宿主的污染。液氮速冻，保存在-80°C，干冰运输 |
| 动物软骨组织 | ≥200 mg | PBS洗涤，用手术刀将软骨切成1cm3左右的小块。液氮速冻，保存在-80°C，干冰运输 |
| 动物毛发 | ≥200 mg | 用适量2%SDS，50mM 磷酸钠（pH7.8）缓冲液漂洗样品，去除污染物，干燥，保存在-80°C，干冰运输 |
| 柔软组织（木本植物的叶、花等，草本科植物，藻类，蕨类植物，大型真菌等） | ≥100 mg | 收集样品，液氮速冻（如果样品表面有泥土或明显污染物，则液氮速冻前用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体），保存在-80°C，干冰运输 |
| 木本科植物的树根、树皮、树枝等 | ≥5 g | 收集样品，液氮速冻（如果样品表面有泥土或明显污染物，则液氮速冻前用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体），保存在-80°C，干冰运输 |
| 果实、种子 | ≥50 mg | 收集样品，液氮速冻（如果样品表面有泥土或明显污染物，则液氮速冻前用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体），保存在-80°C，干冰运输 |
| 果肉 | ≥5 g | 去皮切成1cm3左右小块，液氮速冻，保存于-80°C，干冰运输 |
| 花粉 | ≥10 mg | 植物开花期收集花粉，解剖显微镜下检查花粉，用解剖针去除花药碎片等杂质，转入EP管中，光学显微镜下检查花粉的形态和纯度。保存于-80°C，干冰运输 |
| 细菌菌类 | ≥50 mg | 3000g-5000g离心5-15min，去上清，PBS洗涤沉淀三次，液氮速冻，菌体-80°C保存，干冰运输 |
| 真菌菌体 | ≥5 g | PBS清洗，吸水纸吸去表面液体，液氮速冻，保存于-80°C，干冰运输 |
| 悬浮培养细胞 | ≥2×10^7 | 1)400g-1000g离心10分钟收获细胞，弃上清。 2)用预冷的PBS小心洗涤片状沉淀物2次，置于冰上，去上清。 3)液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 贴壁培养细胞 | ≥2×10^7 | 1)弃掉培养液，并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液 2) 加入4°C预冷的PBS，平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞，然后弃去PBS。 重复以上操作两次以洗去培养液。 3)将培养皿置于冰上。向培养皿内加入4°C预冷的PBS。用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），冰上斜置培养皿，使得缓冲液流向一侧。移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内。离心去上清。 4)液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 血清 | ≥100 μL | 收集好的全血室温静置两小时，3000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 血浆 | ≥100 μL | 收集好的全血加入抗凝剂，室温静止30分钟，1300g-2000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 |
| 动物乳汁或人乳汁 | ≥3 mL | 收集母乳，-80°C保存，干冰运输。若要去除样品中的高丰度酪蛋白，需要超速离心除去 |
| 乳脂肪球膜蛋白（MFGM），即脂质层 | ≥150 μL | 收集母乳，4度高速离心15min，取脂质层，用预冷的5倍体积的PBS洗涤3次，纯水洗涤一次，-80°C保存，干冰运输 |
| 脑脊液、关节液、淋巴液、附睾腔液 | ≥50 μL | 1000g-2000g离心5min，（或使用0.22µm滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 |
| 唾液 | ≥100 μL | 禁食两小时以上，9-12am取样，1000g-2000g离心5min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 |
| 泪液 | ≥300 μL | 收集样品（可利用capillary micropipette或Schirmer strip），8000-14000g 4度 离心5min，取上清， -80°C保存，干冰运输 |
| 尿液 | ≥10 mL | 5000×g 4°C 离心30-60min，取上清， -80°C保存，干冰运输 |
| 分泌蛋白-细胞分泌液 | ≥5 mL | 10000g-20000g离心30-60min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 |
| 分泌蛋白-脑组织分泌液 | ≥5 mL | 10000g-20000g离心30-60min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 |
| 分泌蛋白-间质液 | ≥100 μL | 样品收集，-80°C保存，干冰运输 |
| IP样品 | ≥50 μg | 样品洗脱时，建议采取酸性洗脱模式，wash buffer中不建议含有去垢剂（SDS,NP-40,Triton-X100）,若需要使用去垢剂作为洗脱溶液，则需要采用SDS-PAGE对样本进行预处理，送样前，迅速液氮中速冻，并保存于-80°C中，干冰运输 |
TMT (Tandem Mass Tag) 技术是一种用于蛋白质组学研究的同位素标记定量方法。与 iTRAQ 技术类似，TMT 也使用特定的同位素标签来标记来自不同样品的肽段，并通过质谱分析来比较这些标记肽段的强度，从而进行蛋白质定量分析。以下是关于 TMT 蛋白组技术检测蛋白的一些常见疑问及其解答：
1、TMT 技术的工作原理是什么？
解答：TMT 技术使用一种特殊的试剂，其中包含多个同位素标记的基团。这些标记试剂与肽段的 N 端或赖氨酸侧链连接，形成具有不同质量数的标记肽段。标记后的肽段混合在一起，通过质谱分析，每个标记肽段都会产生一个独特的报告离子。通过比较这些报告离子的强度，可以定量不同样品中肽段的相对丰度，进而推导出蛋白质的定量信息。
2、TMT 技术与 iTRAQ 技术有何不同？
解答：TMT 技术与 iTRAQ 技术的主要区别在于标记试剂的种类和数量。TMT 技术使用的标记试剂可以提供更多的标记组合，从而允许在一次实验中同时分析更多的样品（最多可达 16 个）。此外，TMT 技术的报告离子强度通常更高，可能提供更好的定量准确性。
3、TMT 技术有哪些优点？
解答：TMT 技术的优点包括高通量、高灵敏度、高准确性和灵活性。该技术可以同时分析多个样品，减少了实验时间和成本。TMT 标记试剂的设计使得标记过程相对简单和快速。此外，由于报告离子的强度较高，TMT 技术通常具有较好的定量准确性。
4、TMT 技术需要注意哪些问题？
解答：在使用 TMT 技术进行蛋白质组学研究时，需要注意样品的质量、标记效率、质谱分析的参数设置等问题。样品应尽可能纯净，以减少杂质对定量结果的干扰。标记效率会影响定量准确性，因此需要优化标记条件。此外，质谱分析过程中的参数设置也会影响定量结果的准确性和可靠性。
5、TMT 技术在哪些领域有应用？
解答：TMT 技术广泛应用于生物学、医学和药学等领域的研究。例如，该技术可以用于研究疾病发生发展过程中的蛋白质表达变化、药物作用机制的探索以及生物标志物的发现等。TMT 技术的高通量特性使其特别适用于大型研究项目，如人类蛋白质组计划等。
