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蛋白质大规模定性
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蛋白质鉴定&蛋白质表达谱构建
一、 蛋白质大规模鉴定（LC-MS/MS SHOTGUN)分析：
1999年，Yates研究组提出“鸟枪法”(shotgun)，其基本技术路线是针对液体或SDS-PAGE条带的复杂混合物用酶（Trypsin）酶解成肽段混合物，然后对肽混合物进行多维毛细管液相色谱分离和串联质谱分析以及数据库检索，从而确定蛋白质的种类，可同时鉴定成百上千种蛋白质。他们把这种思路称为多维蛋白质鉴定技术，即Mud PIT(multidi-mensional protein identification technology)。与传统的双向电泳技术相比具有灵敏度更高，动态检测范围更广等特点。研究对象是完整的组织、体液或其提取物，其目的在于鉴定出尽可能多的肽和蛋白质分子。将溶液内蛋白质分子或SDS-PAGE条带的复杂混合物酶解成肽段混合物，通过液相色谱分离，如2D-LC（阳离子柱SCX和C18反相柱串联）或1D-LC的C18反相柱，串联质谱测试，最后用相应的数据库进行检索匹配，可同时鉴定成百上千种蛋白质。
二、实验流程
典型数据结果
| 产品名称 | 样品类型 | 送样量 | 预处理和保存 | 备注 |
| LC-MS/MS鉴定 | 胶条 | SDS-PAGE条带 | 将需要鉴定的SDS-PAGE条带切下，装进EP管，常温或冰袋寄送，颜色非常浅的条带可取多个重复样本放一起，常温或冰袋寄送 | |
| 胶点 | 肉眼可见 | 用移液枪头将2D点挖下来，加入已装有超纯水的EP管中，做好标记，常温或冰袋寄送 | ||
| 蛋白干粉 | 100 μg | 冻干的蛋白粉末装入EP管，常温或冰袋寄送 | ||
| 蛋白溶液 | 1 μg/μL*20μL | 提好的蛋白溶液保存于-80°C，干冰寄送 | 溶液中一般不要有SDS、CHAPS、Triton X-100、NP40及吐温20、40等系列的去污剂，如果有，请在送样单上注明；盐浓度小于50mM | |
| 外泌体-细胞培养上清 | ≥30 mL | 10000g-20000g离心30-60min，（或使用0.22um滤膜过滤），取上清，-80°C保存，干冰运输 | ||
| 外泌体-血清 | ≥2 mL | 收集好的全血室温静置两小时，3000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 | ||
| 外泌体-血浆 | ≥2 mL | 收集好的全血加入抗凝剂，室温静止30分钟，1300g-2000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80°C保存，干冰运输 | ||
| 外泌体-尿液 | ≥30 mL | 5000×g 4°C 离心30-60min，取上清， -80°C保存，干冰运输 |
蛋白质QE鉴定（Quality Evaluation）通常涉及对蛋白质样本的质量、纯度和完整性进行评估。在蛋白质QE鉴定过程中，研究者可能会遇到一些常见的问题和疑问。以下是一些可能的疑问及其解答：
1、如何确定蛋白质样本的纯度？
可以通过凝胶电泳（如SDS-PAGE）、高效液相色谱（HPLC）或质谱分析（MS）等方法来评估蛋白质样本的纯度。这些方法可以帮助检测样本中是否存在其他杂质或蛋白质。
2、如何验证蛋白质样本的完整性？
完整性可以通过检查蛋白质的大小、翻译后修饰（如糖基化、磷酸化等）以及是否存在降解产物来评估。质谱分析可以提供这些信息，并帮助确定蛋白质是否保持了其天然状态。
3、蛋白质样本是否需要进一步纯化以提高鉴定准确性？
如果蛋白质样本中存在杂质或污染物，它们可能会干扰鉴定过程。因此，在某些情况下，进一步纯化蛋白质样本以提高其纯度可能是必要的。
4、如何选择合适的蛋白质鉴定方法？
选择哪种鉴定方法取决于研究目的、样本性质以及实验室可用的技术和资源。质谱分析是常用的蛋白质鉴定方法，但也可能需要使用其他技术，如凝胶电泳、免疫印迹（Western blot）等。
5、蛋白质QE鉴定需要多少样本量？
样本量取决于所使用的鉴定方法以及蛋白质本身的丰度。某些方法可能需要更多的样本才能获得可靠的结果。
6、如何处理蛋白质样本以进行QE鉴定？
样本处理通常包括蛋白质提取、纯化、浓度测定和可能的样品准备步骤（如变性、还原等）。这些步骤应根据所使用的鉴定方法进行优化。
7、QE鉴定结果如何解读？
QE鉴定结果应该根据实验设计和所使用的方法进行仔细解读。通常，这需要综合考虑多种数据，如质谱数据、电泳图谱等，并与已知数据库进行比较以进行鉴定。
8、如何评估QE鉴定的准确性和可靠性？
准确性和可靠性可以通过使用内部对照、重复实验、与已知序列进行比较以及使用统计方法来评估。此外，参与实验室间的比较和验证也可以提高鉴定结果的可靠性。
