免疫共沉淀（Co-IP）实验中可能会遇到多种常见问题，以下是一些常见的问题及其可能的原因和解决方案：

1、高背景：

可能原因：非特异性蛋白结合、转移膜上的非特异性吸附等。

解决方案：在无血清培养液中裂解细胞以减少非特异性蛋白结合；注意实验操作，戴手套、用镊子夹取、不接触转移膜转移面等以避免非特异性吸附。

2、实验失败：

可能原因：样品被蛋白酶降解、抗体浓度太低或亲和力低、IP抗体未与agarose珠子结合等。

解决方案：在裂解样品中加入蛋白酶抑制剂，注意冰上操作，避免反复冻融；调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；选用合适的agarose珠子，正确保存防止变质或干燥。

3、抗体选择：

选择特异性好的抗体，可以考虑使用单抗。

4、未检测到互作蛋白或信号太弱：

可能原因：裂解液中去垢剂浓度过高或配方太强烈、蛋白和蛋白之间的相互作用太弱或不稳定等。

解决方案：优化裂解液配方，降低去垢剂浓度；尝试使用不同的细胞或组织裂解条件；确保样品新鲜，并加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂。

5、Co-IP验证结果与其他验证方式不一致：

可能原因：Co-IP中存在中间蛋白参与互作，而其他验证方式无法检测到这种互作。

解决方案：综合考虑多种验证方式的结果，结合其他实验数据进行分析。

6、选择合适的Input对照和同型对照：

使用实验使用的细胞裂解液作为Input对照，同型对照可以选择与实验抗体相同种属但特异性不同的抗体。

7、互作验证一定要使用Western Blot吗？

可见蛋白只能判断蛋白大小，不能确定是否为目的蛋白，因此通常需要Western Blot进行确认。

8、Input的带型不够亮：

解决方案：可以尝试瞬转过表达处理。

9、抗体浓度和加样量：

通常需要进行优化，摸索最佳抗体浓度和加样量。

10、避免假阳性：

选择特异性抗体是关键，特异性抗体可以排除非特异性结合进而排除假阳性。