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细胞增殖与毒性实验
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一、简介：
细胞毒性检测是生物相容性测试的一种，检测药物或者新型材料在生物环境中的毒性情况，即通过检测材料或者药物对细胞的增殖或者生长的影响，来评价药物或材料的毒性或者活性，主要用于药物活性筛选、细胞增殖/毒性测定、抗肿瘤药效计算IC50等；常用MTT法或者CCK8法检测，另外也可以通过Live/dead双染法进行细胞成像，更直观的记录细胞的存活情况。
1. 实验原理
CCK-8（cell-counting kit-8）检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原，WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值（450nm）并进行统计学计算便可以获得细胞毒性相关数据。
2. 参考标准
GBT16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验；ISO 10993-12 2007；
3. 实验流程图
1. 实验原理
哺乳动物胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度（570nm），从而定量测定细胞的存活比例。
2. 实验流程图
1. 交付内容
（1）将各组吸光度值输入Excel并计算相对活力（相对活力%=实验组OD值/对照组OD值均值×100%，将相对活力数值输入GraphPad Prism作图，结果如下：
<图1> 不同浓度下细胞的相对存活率，注：与control组比较，**P＜0.01
1. 交付内容
2D模式拍摄：每个样品3-4张图片，其中①若一个样品拍摄1个倍数，拍4个视野②若一个样品拍摄2个倍数，各拍摄2个视野③若一个样品拍摄3个倍数，各拍摄1个视野。
2. 结果展示
（1）送样量：a. 与细胞的作用方式为直接接触的话，至少3个/种细胞/时间点；b.样本处理方式为浸提的话，可参考国标ISO 10993-12 2007中的浸提方式浸提，根据浸提方式按量和检测时间点提供；
（2）制样要求：若是需要把细胞接种到材料上的话，金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形，建议制备直径为5-7 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪，默认制备直径为6 mm。
送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的3-5倍的量寄送；若采用稀释后样本测试，则须告知稀释倍数及工作液浓度；若溶剂为有机溶剂（如DMSO，醇类，酚类等），最高工作液浓度中，溶剂的占比低于0.5%。
送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的3-5倍的量寄送；其中：
a. 可溶性粉末：注明溶剂的种类（如无水乙醇，异丙醇，DMSO，培养基，PBS或者生盐水等），当样品对溶剂有特殊需求时，请在送样时附加所需溶剂；
b. 不可溶粉末：注明样本性质，灭菌方式，及分散为均匀悬浮液所需必要步骤，
<如果不可使用分散液，需要预试，样本量可联系本公司人员确认>
注：默认每组3个平行，每孔培养基加样量100μL。
哺乳动物胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度（570nm），从而定量测定细胞的存活比例。
CCK-8（cell-counting kit-8）检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原，WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值（450nm）并进行统计学计算便可以获得细胞毒性相关数据。
目前可以开展温高压蒸汽灭菌，紫外照射灭菌，还过滤除菌等。高温高压蒸汽灭菌（121℃、20min），最彻底的灭菌方法，推荐用此方法灭菌；或者酒精浸泡（30min），但样品不能溶于酒精；另外紫外照射灭菌（30min），不太彻底，如需延长照射让灭菌更彻底需要提前告知；如果是液体样品也可以采用过滤除菌（0.22μm的过滤器），可以除去大部分微生物。
a) 浸提液试验：浸提液试验是使用浸提介质浸提样品，然后通过浸提液与细胞接触来评价细胞毒性的方法，用于细胞毒性定性和定量评定。ISO 10993-12标准升版之后，长期(>24小时，<30天)和持久(>30天)接触的样品在进行细胞毒性评价时，推荐的浸提时间是72小时，因为浸提24小时可能不足以使那些使用超过24小时的器械上的化学物质充分释放。
b) 直接接触试验：直接接触试验是通过样品直接与细胞接触来评价细胞毒性的方法。固体样品可直接置于细胞层与细胞接触，液体样品可直接放置；或放置到生物惰性吸水性的基质上与细胞接触。
MTT：适用贴壁细胞；
CCK8：适用于贴壁细胞和悬浮细胞，与MTT或其它MTT类似产品如XTT和MTS等相比，使用方便，线性范围相对宽，灵敏度更高，重复性也优于MTT，如样品容易沉淀或残留且易溶于DMSO，建议选用CCK8法检测。
如果寄送样品量不足，会造成反复寄样，影响您的实验周期。所以建议根据上述的《样品要求》准备样品量，若遇到样品量不太确定时，可与工作人员联系。
